Modifikasi Sintesis Nukleotida Bertanda [Y

(250 unit/mg) 5 mg/ml, adenosin di-fosfat ... 0,5 M Tris-HCl 50 μl ... 0,2 M Dithiothreitol 30 μl 0,02 M DL-glyceraldehide 25 μl...

0 downloads 28 Views 1MB Size
32

Modifikasi Sintesis Nukleotida Bertanda [Y- P]ATP (Wira Y Rahman, dkk)

MODIFIKASI SINTESIS NUKLEOTIDA BERTANDA [-32P]ATP Wira Y Rahman1*, Endang Sarmini, Herlina, Triyanto, Hambali, Abdul Mutalib, 2 Santi Nurbaiti 1 Pusat Radioisotop dan Radiofarmaka (PRR) - BATAN) 2 Kelompok Keahlian Kimia ITB *Tel/fax : (021)7563141, email: [email protected] ABSTRAK MODIFIKASI SINTESIS NUKLEOTIDA BERTANDA [Y-32P]ATP. Dalam perkembangan biologi molekul, radionuklida dalam bentuk senyawa bertanda telah digunakan sebagai perunut deoxyribonucleic acid (DNA)/ribonucleic acid (RNA) untuk mendalami berbagai macam proses fisiologi dan patologi. Salah satu senyawa tersebut adalah nukleotida bertanda fosfor-32 (32P) [γ-32P]-adenosine triphosphate {[γ-32P]ATP} yang banyak digunakan dalam penelitian biologi molekul. Untuk dapat menunjang penelitian biologi molekul di Indonesia, pada penelitian ini telah dilakukan pembuatan senyawa nukleotida bertanda [γ-32P]ATP melalui reaksi enzimatis dengan melakukan modifikasi pada metoda sintesisnya menggunakan prekursor DL-glyceraldehyde 3-phosphate, nukleotida adenosine di-phosphate (ADP) dan H332PO4, serta enzim gliseraldehid 3-phosphat dehidrogense, 3-phosphogliserat-kinase dan laktat dehidrogenase. Pemurnian [γ-32P]-ATP hasil sintesis dengan menggunakan kolom kromatografi DEAE-Sephadex. Dari proses sintesis dan pemurnian yang telah dilakukan berhasil diperoleh [γ-32P]-ATP dengan aktifitas 1,175 mCi dan kemurnian radiokimia 99,49%. Dengan berhasilnya dilakukan sintesis dan pemurnian [γ-32P]-ATP, maka Pusat Radiosiotop dan Radiofarmaka akan dapat menyediakan nukleotida bertanda dimaksud di atas untuk menunjang penelitian biologi molekul di Indonesia. Kata Kunci: nukleotida bertanda [γ-32P]ATP, sintesis, reaksi enzimatis, pemurnian ABSTRACT MODIFICATION OF SYNTHESIS NUCLEOTIDES [Y-32P] ATP. In molecular biology, radionuclides in the form of radiolabeled compounds have been widely used as deoxyribonucleic acid (DNA) / ribonucleic acid (RNA) tracer in order to explore a wide range of physiological and pathological processes. One of such compounds is [γ-32P]-adenosine triphosphate {[γ-32P]-ATP} [γ-32P]-ATP which has been widely used in the biotechnology research. In order to support the biotechnology research in Indonesia in this project, [γ-32P]ATP had been synthesized by enzymatic reactions with modifying the method of synthesis using the precursor DL-glyceraldehydde 3-phosphate, nucleotides Adenosine Diphosphate (ADP) and H332PO4 and enzymes glyceraldehid 3-phosphate dehydrogenase, 3-phosphoglyceryc phosphokinase and lactate dehydrogenase. The purification of the synthesized [γ-32P]-ATP, by using DEAE Sephadex column chromatography. The synthesis and purification process that had been performed were able in producing of [γ-32P]-ATP with radioactivity of 1,175 mCi and radiochemical purity of 99,49%.. Having successfully prepared the [γ-32P]-ATP and application, in the near future the Radioiotopes and Radiopharmaceuticals Centre is expected to be able in providing the above-mentioned radiolabeled nucleotide for biotechnology research in Indonesia. Key words : labeled nucleotide [γ-32P]-ATP, synthesis, enzimatic reaction, purification

30

Jurnal Radioisotop dan Radiofarmaka Journal of Radioisotopes and Radiopharmaceuticals Vol 16 No 1 April 2013

ISSN 1410-8542

elektroforesis agarosa. Setelah DNA terpisah,

PENDAHULUAN

dilanjutkan dengan tahap blotting yaitu pemindahan

Pemanfaatan teknologi nuklir untuk kesejahteraan

DNA dari gel agarosa ke membran nitroselulosa.

manusia telah merambah berbagai bidang kehidupan

Proses

seperti kesehatan, industri, riset kebumian, energi,

Tekanan diberikan secara merata pada gel untuk

digunakan dalam

memastikan terjadi kontak antara gel dengan

pencitraan untuk memperoleh informasi fungsional

membran. Proses transfer berlangsung dengan

suatu senyawa, melainkan juga untuk mendalami

memanfaatkan daya kapilaritas. Setelah DNA

berbagai proses fisiologi dan patologi. [1,2,3]

ditransfer ke membran, membran nitroselulosa

Salah satu aplikasi teknologi nuklir dalam

dipanaskan pada suhu tinggi (60-100°C) kemudian

bidang kesehatan yang dikombinasikan dengan

diradiasi sinar UV sehingga terbentuk ikatan

teknik biologi molekul adalah deteksi virus hepatitis

kovalen antara pita-pita DNA dengan membran.

C. Deteksi ini dilakukan melalui penentuan urutan

Selanjutnya, membran dicampur dengan pelacak

asam nukleat DNA virus menggunakan teknik

yang telah dilabel radioaktif dan dilanjutkan dengan

polymerase chain reaction (PCR) dan hibridisasi dot

inkubasi sehingga terjadi proses hibridisasi. Pelacak

blot. Teknik hibridisasi membutuhkan pelacak

akan mengikat bagian-bagian yang merupakan

(probe) yang berperan untuk mendeteksi fragmen yang

spesifik

tersebut.

komplemennya pada DNA dan "melekat" pada

Pelacak

membran. Setelah proses hibridisasi, pelacak yang

merupakan asam nukleat rantai pendek beruntai

tidak terikat dicuci dari membran sehingga yang

tunggal (untai tunggal RNA atau DNA) yang

tertinggal hanya hibrid pelacak-DNA di membran.

memiliki sekuen spesifik yang akan dideteksi dan

Pola

berlabel radioaktif P-32, salah satunya adalah [γ32

P]ATP

[4,5,6]

.

Teknik

penggunaan

hibridisasi

kemudian

dideteksi

dengan

visualisasi pada film X-ray melalui autoradiografi

pelacak

[7,8,9]

.

DNA/RNA untuk mendeteksi gen atau fragmen

Hanya bagian-bagian dari sampel tempat

lokasi gen yang terlihat sebagai titik gelap pada film,

DNA yang diinginkan atau untuk mendeteksi klon

karena

yang benar dikenal dengan nama teknik Southern

pada

bagian

tersebut

terikat

pelacak

radioaktif.

Blotting [7,8,9].

Penelitian ini bertujuan untuk membuat

Tahap awal metode Southern Bloting adalah pemotongan

meletakkan

membran diletakkan pada bagian bawah gel.

terakhir ini aplikasi radioisotop telah berkembang

virus

dengan

Pada teknik blotting yang menggunakan vakum,

kelautan dan hidrologi, dan lain-lain. Selama dekade

DNA

dilakukan

membran nitroselulosa pada bagian atas gel agarosa.

pangan dan pertanian, ilmu fisika dan kimia, serta

dengan cepat, tidak hanya

transfer

DNA

dengan

enzim

senyawa nukleotida bertanda [-32P]ATP yang akan

restriksi

endonuklease sehingga terbentuk fragmen-fragmen

digunakan untuk penelitian dalam bidang biologi

DNA yang lebih kecil. Kemudian DNA dipisahkan

molekul.

berdasarkan

menggunakan reaksi enzimatis.

ukuran

dengan

menggunakan

31

Sintesis

[-32P]ATP

dilakukan

32

Modifikasi Sintesis Nukleotida Bertanda [Y- P]ATP (Wira Y Rahman, dkk)

Pada proses sintesis nukleotida bertanda P-

yang

32 telah dilakukan dengan menggunakan metoda yang

dikembangkan

oleh

Sakamoto

[10]

dilakukan

menggunakan

oleh

Sakamoto

DL-gliseraldehid

3-fosfat.

dengan Pada

yaitu

metoda ini digunakan oxidizing dyes untuk merubah

memanfaatkan sebagian jalur glikolisis. Ternyata

molekul NAD+ menjadi NADH, karena oxidizing

rendemen hasil sintesis yang diperoleh hanya

dyes tersebut fungsinya sama dengan lactate

mencapai 33,46 %, maka untuk mendapatkan hasil

dehydrogenase, maka oxidizing dyes tersebut diganti

yang lebih optimal dilakukan modifikasi metoda

dengan lactate dehydrogenase yang akan merubah

berdasarkan metoda yang digunakan oleh Schendell

molekul NAD+ menjadi NADH, seperti ditunjukkan

& Wells[11], dengan memperpendek proses sintesis

pada Gambar 1.

Gambar 1. Modifikasi proses Schendell & Wells dengan menggunakan enzim lactate dehydrogenase Dalam metoda ini proses sintesis nukleotida

berubah menjadi 3-fosfogliserat dengan bantuan

bertanda P-32 dimulai dari DL-gliseraldehid 3fosfat, yang bereaksi dengan asam fosfat

enzim

(H332PO4)

fosfogliserat

kinase,

disertai

perubahan ADP menjadi ATP. Kemudian dilakukan

menghasilkan 1,3–disfosfogliseraldehid. Senyawa

pemurnian

1,3-difosfogliseraldehid berubah menjadi asam 1,3-

penukar anion DEAE-Sephadex.

difosfogliserat dengan bantuan enzim gliseraldehid++

3-fosfat dehidrogenase, kofaktor ion Mg

dengan

dengan

Seiring

menggunakan

dengan

kromatografi

perkembangan

biologi

serta

molekul di Indonesia maka kebutuhan akan senyawa

koenzim NAD+. Selama reaksi berlangsung molekul

nukleotida bertanda untuk perunut menjadi sangat

NAD+ akan berubah menjadi NADH. Molekul

penting. Untuk itu penguasaan teknik sintesis

NADH

nukleotida

ini

dengan

bantuan

enzim

laktat

dehidrogenase akan berubah kembali menjadi NAD

+

Senyawa

1,3-difosfogliserat

akan

sangat

mendukung

peningkatan kemampuan di bidang biologi molekul.

disertai pengubahan asam piruvat menjadi asam laktat.

bertanda

selanjutnya 32

Jurnal Radioisotop dan Radiofarmaka Journal of Radioisotopes and Radiopharmaceuticals Vol 16 No 1 April 2013

ISSN 1410-8542

TATA KERJA Bahan-bahan

yang

digunakan

500 mM 120 mM 1 mM 125 mM 200 mM 20 mM 5 mM 20 mM

dalam

penelitian ini adalah H332PO4 bebas pengemban dengan kemurnian radiokimia diatas 97%. Enzim gliseraldehid-3-phosphat

dehidrogenase

(80

unit/mg) 10 mg/ml, phosphogliserat kinase (450 unit/mg) 10 mg/ml,

Tris-HCl Magnesium Klorida EDTA Natrium piruvat Dithiothreitol Fructose 1,6-bisphosphate ADP β-NAD

50 μl 20 μl 15 μl 5 μl 5 μl 5 μl

dithiothreitol, tris-HCl,

3. Preparasi pereaksi campuran untuk buffer pelet

etilendiamintetraasetat (EDTA), DL-gliseraldehid 3-

enzim. Pembuatan larutan campuran B : 50 μl

fosfat dari Sigma Aldrich.

larutan berikut disiapkan dalam satu tabung

Sedangkan laktat

dehidrogenase (250 unit/mg) 5 mg/ml, adenosin di-

mikro:

fosfat (ADP), β-nicotinamide adenine dinucleotide

500 mM 120 mM 1 mM 200 mM

(NAD), magnesium klorida dari Merck. Bahan penunjang yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya yaitu kolom kromatografi

4. Preparasi

Dowex AG 50 (1x8), kolom kromatografi DEAE-

Tris-HCl Magnesium Klorida EDTA Dithiothreitol air campuran

enzim.

5 μl 1,5 μl 43,5 μl Pembuatan

Sephadex dengan pendingin, kromatografi lapisan

campuran enzim : 12 μl campuran enzim berikut

tipis

dibuat didalam satu tabung mikro:

(KLT),

cellulose

dari

plastik

polyethyleneimine

E.Merck,

kertas

(PEI)

indikator

Aldolase Glyceraldehydes-3phosphate dehydrogenase Lactate dehydrogenase 3-phosphoglycerate kinase

pH

universal, peralatan gelas dan tabung mikro. Peralatan yang digunakan yaitu sentrifuga berpendingin ( refrigerated centrifuge) (Allegra

6 μl

(0,54 units)

2 μl

(1,6 units)

2 μl 2 μl

(2,5 units) (0,9 units)

Beckman Coulter), penangas air (Memmert), Mini

Campuran enzim tersebut disentrifugasi

TLC Scanner (Bioscan AR-2000), dan Liquid

pada kecepatan 15000 rpm selama 20 menit ,

Scintilation Counter (LSC) (MicroBeta Trilux).

setelah diambil supernatannya, endapan enzim

kemudian dilarutkan dengan 10 μl larutan campuran B.

Cara Kerja Metoda Pertama 1.

Preparasi campuran yang digunakan

2.

Pembuatan larutan campuran A : 100 μl

5. Proses pemisahan hasil sintesis [γ-32P]ATP Hasil

proses

penandaan

dipisahkan

dengan

campuran berikut ini dibuat dalam satu tabung

menggunakan kolom DEAE-Sephadex yang telah

mikro:

dikondisikan dengan larutan NH4HCO3. Kolom dielusi dengan 16 ml NH4HCO3 0,01 M dengan tujuan menghilangkan enzim. Kemudian kolom dielusi dengan 10 ml NH4HCO3 0,1 M dengan tujuan menghilangkan sisa ADP dan ATP yang

33

32

Modifikasi Sintesis Nukleotida Bertanda [Y- P]ATP (Wira Y Rahman, dkk)

tidak bereaksi. Kolom dielusi kembali dengan 15 ml

3. Preparasi

campuran

enzim.

Pembuatan

NH4HCO3 0,23 M bertujuan untuk menghilangkan

campuran enzim : 12 μL campuran enzim berikut

P-32 yang tidak bereaksi didapatkan fraksi 1 – 10,

dibuat didalam satu tabung mikro

masing-masing fraksi 1,5 ml.

Glyceraldehydes-3-

ATP yang telah

50 μl

(40 units)

tertandai P-32, [γ-32P]ATP selanjutnya dielusi dari

phosphate dehydrogenase

kolom dengan 10 ml NH4HCO3 0,4 M (fraksi 22 –

Lactate dehydrogenase

50 μl

(62,5 units)

26).

3-phosphoglycerate

50 μl

(225 units)

Aktivitas masing-masing fraksi diukur dan

phosphokinase

dibuat grafik antara aktivitas terhadap nomor fraksi. Puncak ATP ditentukan dengan LSC dan TLC PEI

Campuran enzim tersebut disentrifugasi

Cellulose.

pada kecepatan 15000 rpm selama 20 menit. Setelah diambil supernatannya, endapan enzim 32

6. Pengujian/Karakterisasi hasil sintesis [γ- P]ATP

kemudian

Hasil penandaan dikarakterisasi dengan TLC PEI

campuran B.

dilarutkan

dengan

50

μL

larutan

Cellulose sebagai fasa diam dan KH2PO4 0,5 M pH 3,5 sebagai fasa gerak. Kemudian ditentukan Rf-nya

4. Proses sintesis [γ-32P]ATP

dengan Bioscanner

Ke dalam tabung mikro bervolume 1,5 ml dimasukkan 40 μl H332PO4 (aktivitas terukur) diatur

Cara Kerja Metoda Kedua 1. Preparasi

campuran

pH 7-9 dengan larutan 5M NaOH. Selanjutnya ke yang

digunakan.

dalam larutan tersebut ditambahkan berturut-turut 40

100 μL

μl larutan campuran A dan 10 μl campuran enzim.

campuran berikut ini dibuat dalam satu tabung

Inkubasi dilakukan selama (t) menit dan dicuplik

mikro

setiap waktu tertentu selama 1 jam. Reaksi

Pembuatan larutan campuran A:

0,5 M 0,3 M 0,125 M 5 mM 0,2 M 0,02 M 20 mM

Air (aquabidest) Tris-HCl Magnesium Klorida Natrium piruvat ADP Dithiothreitol DL-glyceraldehide β-NAD

25 μl 50 μl 20 μl 12,5 μl 12,5 μl 30 μl 25 μl 25 μl

dihentikan dengan memasukkan tabung mikro ke dalam penangas air bersuhu 70⁰C selama 3 menit untuk menghentikan reaksi enzimatis. Kemudian dilakukan proses pemisahan dengan menggunakan kolom penukar ion DEAE-Sephadex.

2. Preparasi pereaksi campuran untuk buffer pelet

5. Proses pemisahan [γ-32P]ATP hasil sintesis

enzim. Pembuatan larutan campuran B: 50 μL larutan berikut disiapkan dalam satu tabung mikro Air

6. Pengujian/Karakterisasi

42,5 μl

0,5 M Tris-HCl

2,5

0,3 M Magnesium Klorida

2,5 μl

0,2 M Dithiothreitol

2,5 μl

32

P]ATP

34

hasil

sintesis

[γ-

Jurnal Radioisotop dan Radiofarmaka Journal of Radioisotopes and Radiopharmaceuticals Vol 16 No 1 April 2013

ISSN 1410-8542

larutan KH2PO4 0,5 M pH 3,5 sebagai fasa gerak,

HASIL DAN PEMBAHASAN [γ- P]ATP

Dari proses pemurnian radioisotop H332PO4 tersebut

P dalam bentuk H332PO4, maka hal

diperoleh kemurnian radiokimianya >97%, dengan

Dalam dibutuhkan

proses

penyiapan

32

32

pertama yang dilakukan adalah melakukan uji

Rf 0,690 seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2.

kualitas H332PO4 yang akan digunakan dalam proses

Dilakukan proses sintesis nukleotida

sintesis yang dimaksud di atas. Hal ini dilakukan karena radionuklida

32

P berupa larutan

bertanda

H332PO4

P-32

menggunakan

(dalam bentuk orto-fosfat) cenderung tidak stabil

dengan

metoda

pertama

radioisotop P-32 yang telah

dimurnikan dengan aktivitas 3,15 mCi sebanyak

dalam penyimpanan dan mudah berubah menjadi

200 μL, dengan lama waktu inkubasi 90 menit.

senyawa polifosfat. Pemurnian radioisotop P-32

Setiap

menggunakan kolom kromatogafi penukar kation

30

menit

dicuplik

untuk

melihat

nukleotida [γ-32P]ATP yang terbentuk, hasilnya

Dowex AG 50 (1 x 8) yang telah dikondisikan

dapat

dengan HCl 0,1M, sehingga diperoleh larutan

dilihat

pada

Gambar

3.

diperoleh

H332PO4 dengan kemurnian radiokimia yang tinggi

rendemen 25,13 % dengan Rf 0,295 setelah

dan layak digunakan untuk pembuatan nukleotida

waktu

bertanda [γ-32P]ATP. Analisa kemurnian radiokimia

pembentukan

H332PO4 dilakukan dengan sistim KLT, dengan

32P]ATP setiap 30 menit selama waktu

menggunakan PEI Cellulose sebagai fasa diam dan

inkubasi 90 menit dapat dilihat pada gambar 3.

inkubasi

90

nukleotida

Gambar 2. Radiokromatogram P-32 hasil pemurnian

35

menit.

Rendemen

bertanda P-32 [Y-

32

Modifikasi Sintesis Nukleotida Bertanda [Y- P]ATP (Wira Y Rahman, dkk)

Gambar 3. Radiokromatogram hasil sintesis nukleotida bertanda P-32 [γ-32P]ATP dengan waktu inkubasi 90 menit

Gambar 4. Rendemen pembentukan nukleotida bertanda P-32 [γ-32P]ATP dengan waktu inkubasi selama 90 menit

Dari Gambar 4 terlihat ada peningkatan

Kemudian dilakukan pemisahan dengan

rendemen seiring dengan bertambahnya waktu

menggunakan kolom DEAE Sephadex yang telah

inkubasi, tetapi rendemen yang diperoleh masih

dikondisikan dengan larutan NH4HCO3 0,01 M, ph

rendah, 25,15% dengan waktu inkubasi yang telah

7,5. Kolom kemudian berturut-turut dielusi dengan

mencapai 90 menit. Sementara dari literatur

larutan NH4HCO3 0,01 M untuk menghilangkan sisa

diketahui bahwa rendemen pembentukan bisa

enzim,

mencapai

menit.

menghilangkan ADP dan ATP yang tidak bereaksi,

Kemungkinannya pemecahan fruktosa-1,6-disfosfat

larutan NH4HCO3 0,23 M untuk menghilangkan P-

oleh enzim aldolase menjadi

Glyceraldehyde 3-

32 yang tidak bereaksi. Kolom kemudian dielusi

phosphate tidak optimal, yang akan mempengaruhi

dengan larutan NH4HCO3 0,4 M untuk mendapatkan

jumlah perubahan ADP menjadi ATP bertanda P-32.

nukleotida yang telah bertandaP-32, [γ-32P]ATP.

95%

dalam

waktu

5

36

larutan

NH4HCO3

0,1

M

untuk

Jurnal Radioisotop dan Radiofarmaka Journal of Radioisotopes and Radiopharmaceuticals Vol 16 No 1 April 2013

ISSN 1410-8542

Hasil fraksinasi proses pemisahan sintesis nukleotida

Untuk

menentukan

kemurnian

hasil

bertanda P-32 dengan waktu inkubasi selama 90

pemisahan dilakukan analisa dengan menggunakan

menit dapat dilihat pada Gambar 5.

KLT PEI cellulose sebagai fasa diam dan larutan

Fraksi 11

sampai 14 adalah P-32 yang tidak berekasi,

KH2PO4

ph

3,5

sebagai

fasa

gerak.

sedangkan fraksi 24, 25 dan 26 adalah nukleotida

radiokromatogram nukleotida bertanda P-32 pada Rf

bertanda P-32.

0,317 diperoleh 99,94 % seperti pada Gambar 6.

Gambar 5. Hasil fraksinasi proses pemisahan sintesis nukleotida bertanda P-32 dengan waktu inkubasi selama 90 menit

Gambar 6. Radikromatogram nukleotida bertanda P-32 hasil pemisahan fraksi 25 dengan waktu inkubasi 90 menit

37

Hasil

32

Modifikasi Sintesis Nukleotida Bertanda [Y- P]ATP (Wira Y Rahman, dkk)

Tabel 1. Aktivitas dan kemurnian radiokimia yang diperoleh masing-masing fraksi

Fraksi Aktivitas (μCi) Kemurnian (%)

24 533 99,88

25 642 99,96

26 577 99,96

Gambar 7. Radikromatogram nukleotida bertanda P-32 setelah proses pencucian dan pelarutan dengan Tricine Masing-masing fraksi kemudian disatukan

menggunakan metoda kedua, metoda Schendel &

dan dimurnikan dengan mengeringkan dalam freeze

Wells yang telah dimodifikasi.

dryer, kemudian dilarutkan dengan 1 ml aquabides

Pada metoda Schendel & Wells ini pada

dan kembali dikeringkan dengan freeze dryer,

campuran pereaksinya tidak menggunakan larutan

pencucian dengan aquabides dilakukan 2 kali. Hasil

EDTA, karena larutan EDTA tersebut digunakan

pengeringan kemudian dilarutkan dengan 0,05 M

untuk menghentikan reaksi enzimatis, sementara

Tricine pH 7,6, sebanyak 25 μL, dicuplik 2,5 μL

dalam metoda Sakamoto digunakan larutan EDTA

untuk dianalisa dengan menggunakan TLC PEI

dalam campuran perekasinya, kemungkinan larutan

Cellulose, diperoleh hasilnya dengan aktivitas 4,96

EDTA ini menghambat laju reaksi enzimatis

μCi/μL

dengan

kemurnian

radiokromatogramnya

yang

97,02%,

hasil

sehingga rendemennya menjadi rendah. Sintesis

ditunjukkan

pada

dimulai dari DL- Glyceraldehyde 3-phosphate

Gambar 7.

dengan menggunakan tiga campuran enzim yaitu

Dari metoda pertama tersebut memberikan

lactate dehydrogenase, Glyceraldehydes 3-phosphate

rendemen [γ-32P]ATP hanya sampai 25,15% dengan

dehydrogenase

serta

3-phosphoglycerate

H332PO4

waktu inkubasi mencapai 90 menit, sehingga

phosphokinase. Larutan

dianggap proses sintesis tersebut kurang berhasil,

harus dimurnikan terlebih dahulu.

maka

dilakukan

proses

sintesis

dengan 38

yang digunakan

Jurnal Radioisotop dan Radiofarmaka Journal of Radioisotopes and Radiopharmaceuticals Vol 16 No 1 April 2013

ISSN 1410-8542

Gambar 8. Radiokromatogram larutan H332PO4 setelah proses pemurnian Radiokromatogram dari H332PO4 yang telah

menggunakan DL- Glyceraldehyde 3-phosphate

dimurnikan dengan kolom penukar kation Dowex

sebagai bahan utamanya. Pembentukan [γ-32P]ATP

AG 50 (1 x 8) yang akan digunakan untuk proses

diamati dengan cara mencuplik sejumlah tertentu

sintesis nukleorida bertanda P-32 dapat dilihat pada

sampel setiap 15 menit reaksi yang kemudian

gambar 8.

dianalisis dengan sistim KLT dengan menggunakan

Kemudian nukleotida

bertanda

dilakukan

proses

[-32P]ATP

sintesis

PEI Cellulose sebagai fasa diam dan larutan KH2PO4 0,5 M pH 3,5

menggunakan

sebagai fasa gerak. Rendemen

radioisotop P-32 dengan aktivitas 3,76 mCi,

pembentukan nukleotida bertanda P-32 pada saat 15

sebanyak 200 μL, dengan memperpendek proses

menit

sintesis dan pengurangan enzim aldolase serta

ditunjukkan pada Gambar 9.

inkubasi

mencapai

76,66%,

Gambar 9. Radiokromatogram pembentukan [γ-32P]ATP setelah inkubasi 15 menit

39

Rf

0,275

32

Modifikasi Sintesis Nukleotida Bertanda [Y- P]ATP (Wira Y Rahman, dkk)

Dari kromatogram yang sama juga dapat dilihat masih terdapat 16,44%

H332PO4

terjadi sedikit penurunan, maka proses sintesis

(Rf 0,613)

diulang lagi dengan memperpendek waktu sintesis

bebas atau yang tidak terikat pada ATP. Inkubasi

menjadi 20 menit dengan selang waktu pencuplikan

dilakukan selama 60 menit dan dicuplik setiap 15

setiap 5 menit. Aktivitas yang digunakan untuk

menit, rendemen pembentukan nukelotida bertanda

proses sintesis ini 3,99 mCi sebanyak 200 µL,

32

[γ- P]ATP ditunjukkan pada gambar 10.

ternyata

Terlihat pada menit ke-30 terjadi sedikit

dalam

pembentukan

waktu

nukleotida

5

menit

bertanda

rendemen [γ-32P]ATP

kenaikkan rendemennya, tetapi sampai menit ke-60

mencapai 93,91%, terlihat dari kromatogram yang

tidak terjadi kenaikkan yang cukup signifikan, malah

ditunjukkan pada Gambar 11.

100,00

Rendemen (%)

90,00 80,00 70,00

P-32…

60,00 50,00

0

20

40 Waktu (menit)

60

80

Gambar 10. Rendemen pembentukan nukleotida bertanda P-32 [γ-32P]ATP dengan waktu inkubasi selama 60 menit

Gambar 11. Radiokromatogram pembentukan [γ-32P]ATP setelah inkubasi 5 menit 40

Jurnal Radioisotop dan Radiofarmaka Journal of Radioisotopes and Radiopharmaceuticals Vol 16 No 1 April 2013

ISSN 1410-8542

Gambar 12. Rendemen hasil inkubasi setiap 5 menit pencuplikan Dari

kromatogram

ini

dapat

dilihat

0,1M untuk menghilangkan ADP dan ATP yang

persentase rendemen hasil sintesis [γ- P]ATP

tidak bereaksi dan dengan 15 mL NH4HCO3 0,23 M

sebesar 93,91%, (Rf 0,281). Dari kromatogram yang

untuk menghilangkan P-32 yang tidak bereaksi.

sama juga dapat dilihat masih terdapat 5,04%

Kolom kemudian dielusi dengan 10 mL NH4HCO3

H332PO4

0,4 M untuk mendapatkan ATP yang telah tertandai

32

(Rf 0,663) bebas atau yang tidak terikat

pada ATP. Waktu yang optimal untuk inkubasi

P-32, [γ-32P]ATP.

pembentukan nukleotida bertanda P-32 [γ-32P]ATP

Gambar 13 memperlihatkan profil elusi pemurnian

adalah 5 menit, karena dengan bertambahnya waktu

[γ-32P]ATP dengan kolom kromatografi penukar

tidak menambah rendemen pembentukannya seperti

anion DEAE Sephadex menggunakan NH4HCO3

yang ditunjukkan gambar 12.

sebagai eluen. Hasil analisa fraksi-fraksi hasil elusi

Untuk mendapatkan [γ-32P]ATP dengan

dengan KLT menggunakan PEI Cellulose sebagai

kemurnian radiokimia > 90%, dilakukan proses

fasa gerak dan larutan KH2PO4 0,5 M pH 3,5

pemisahan

larutan

sebagai fasa diam memperlihatkan bahwa fraksi 4, 5

(NH4)HCO3 pH 7,5 dengan konsentrasi 0,01 M; 0,1

dan 6 merupakan P-32 bebas yang tidak bereaksi

M; 0,23 M dan 0,4 M sebagai eluen. Pada proses

menjadi [γ-32P]ATP (Rf = 0,6). Sementara itu fraksi

pemurnian ini [γ-32P]ATP masing-masing hasil

17, 18, 19 dan 20 merupakan fraksi [γ-32P]ATP

sintesis dilewatkan ke dalam kolom DEAE-

dengan kemurnian radiokimia >90%. Gambar 14

Sephadex yang telah dikondisikan dengan 10 mL

memperlihatkan kromatogram salah satu fraksi yang

NH4HCO3 0,01 M. Kolom kemudian berturut-turut

dimaksud diatas (fraksi 19), [γ-32P]ATP (Rf = 0,267),

dielusi dengan 20 mL NH4HCO3 0,01 M untuk

dengan kemurnian radiokimia 99,99%.

dengan

menggunakan

menghilangkan enzim, dengan 10 mL NH4HCO3

41

32

Modifikasi Sintesis Nukleotida Bertanda [Y- P]ATP (Wira Y Rahman, dkk)

Wkt inkubasi 60 mnt Wkt inkubasi 20 mnt

1500,0 Aktivitas (uCi)

1000,0 500,0 0,0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Nomor Fraksi (1,5ml/fraksi)

Gambar 13. Profil elusi pemisahan [γ-32P]ATP dengan kolom kromatografi penukar anion DEAE Sephadex menggunakan NH4HCO3 sebagai larutan pengelusi

Gambar 14. Radiokromatogram fraksi 19 dari hasil proses pemisahan [γ-32P]ATP menggunakan kolom penukar anion DEAE Sephadex dan NH4HCO3 sebagai eluen

Masing-masing fraksi dengan kemurnian

kemudian dilarutkan dengan 0,05 M Tricine pH 7,6,

diatas 95% dikumpulkan, kemudian dimurnikan

sebanyak 300 μL dengan aktivitas 1,175 mCi,

dengan mengeringkan dalam freeze dryer, kemudian

dicuplik

dilarutkan dengan 3 ml aquabides dan kembali

menggunakan

dikeringkan dengan freeze dryer, pencucian dengan

radiokimianya 99,49 %, hasil radiokromatogramnya

aquabides dilakukan 3 kali. Hasil pengeringan

ditunjukkan pada Gambar 15.

42

2,5

μL TLC

untuk PEI

dianalisa Cellulose

dengan kemurnian

Jurnal Radioisotop dan Radiofarmaka Journal of Radioisotopes and Radiopharmaceuticals Vol 16 No 1 April 2013

ISSN 1410-8542

32

P]ATP

dengan

menggunakan

metoda

yang

dimodifikasi dan sebagai bahan utamanya DLgliseraldehid

3-fosfat

memberikan

rendemen

93,91% dengan waktu inkubasi optimum selama 5 menit. Untuk mendapatkan [γ-32P]ATP dengan kemurnian radiokimia yang memenuhi syarat untuk dapat digunakan pada aplikasi teknologi nuklir dalam bidang kesehatan (> 95%), raw product dimurnikan dengan sistim kromatografi dengan menggunakan

yaitu

modifikasi

dari

memberikan hasil [γ32P]-ATP 1,175 mCi dengan kemurnian radiokimianya ~ 99,49%.

metoda DAFTAR PUSTAKA

Schendel & Wells jauh lebih baik hasilnya, dengan waktu inkubasi yang lebih singkat (optimal pada 5

1. FATCHIYAH dan ESTRI LARAS ARUMNINGTYAS. “Kromosom, Gen, DNA, Synthesis Protein dan Regulasi”, Laboratorium Biologi Molekuler dan Selluler Universitas Brawijaya, Malang, 2006

menit pada aktivitas yang sama). Rendemen hasil sintesis setelah proses pengkondisian dengan tricine kemurnian radiokimianya juga lebih baik mencapai

2. NUNUK PRIYANI, “Sifat Fisik dan Kimia DNA”, Program Studi Biologi dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, 2004

99,49%, sementara dari metoda yang digunakan oleh Sakamoto 97,02%.

3. DWI SURYANTO, “Melihat Keanekaragaman Organisme Melalui Beberapa Teknik Genetika Molekuler”, Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara.

KESIMPULAN Sebelum larutan H332PO4 digunakan untuk proses sintesis [γ-32P]ATP terlebih dahulu dilakukan pemurnian dengan cara melewatkan H332PO4 ke

4. SUHARSONO, “Struktur dan Ekspresi Gen”, Jurusan Biologi FMIPA, Institut Pertanian Bogor.

dalam kolom penukar kation Dowex AG 50 (1 x 8) yang

telah

dikondisikan

dengan

Diperoleh kemurnian radiokimia

HCl

H332PO4

dengan

[γ-32P]ATP dengan menggunakan eluen NH4HCO3

Dari kedua metoda yang sudah dilakukan kedua

DEAE-Sephadex

menggunakan eluen NH4HCO3. Proses pemurnian

Gambar 15. Radikromatogram nukleotida bertanda P-32 hasil pemisahan setelah proses pencucian dan pelarutan dengan Tricine

metoda

kolom

0,1M.

5. LEHRINGER, A.L, “Dasar-Dasar Biokimia Jilid I”, Erlangga, Jakarta, 1982

> 99%

6. ARIS TJAHJOLEKSONO, “Teknologi DNA Rekombinan”, Jurusan Biologi FMIPA, Institut Pertanian Bogor.

setelah proses pemurnian ini. Rendemen sintesis dengan menggunakan metoda yang dilakukan oleh Sakamto menberikan hasil 25,15% dengan waktu

7. MUKH. SYAIFUDIN dan DEVITA TETRIANA, “Analisis Mutasi Gen inhA untuk Uji Resistensi M.Tuberculosis terhadap

inkubasi 60 menit. Sementara itu hasil sintesis [γ-

43

32

Modifikasi Sintesis Nukleotida Bertanda [Y- P]ATP (Wira Y Rahman, dkk)

Isoniazid dengan Metode SSCP radioaktif”, Pusat Teknologi Keselamatan dan Metrologi Radiasi, BATAN, Jakarta. 8. MARIA LINA R, BUDIMAN BELA dan ANDI YASMON, “Deteksi Mutasi Gen KATG (MyobacteriumTuberculosis) dengan Metode PCR (Polymerase Chain Reaction) – Hibridisasi Dot Blot menggunakan Pelacak Oligonukleotida Bertanda 32P”, Jurnal Aplikasi Isotop dan Radiasi, 2000. 9. BUDIAWAN, “Pengembangan Teknik 32PPostlabelling untuk Mendeteksi Dini Resiko Kanker”, Risalah Pertemuan Ilmiah Penelitian dan Pengembangan Teknologi Isotop dan Radiasi, 2000. 10. F. SAKAMOTO, M. IZUMO, K. HASHIMOTO, Y. FUJI, “Study of Optimum Condition for Synthesis of [γ-32P]ATP with High Specivic Radioactivity”, Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, Vol. 239, No.2 (1999) 423-427. 11. PAUL F. SCHENDEL and ROBERT D. WELLS, “The Synthetic and Purification of [γ32 P] Adenosine Triphosphate with High Specific Activity”, The Journal of Biology Chemistry, Vol. 248, No. 23, Issue of December 10. 12. WIRA Y RAHMAN, ENDANG SARMINI, HERLINA, dkk, “ Sintesis ATP Bertanda P-32 sebagai Perunut Biologi Molekul”, Pertemuan Ilmiah Radioisotop, Radiofarmaka dan Siklotron, 2010.2

44