Pengaruh Genistein terhadap Penurunan Kadar Vascular

Jehanara et al. : Pengaruh Genistein terhadap Penurunan Kadar VEGF-A pada Kultur Sel Endometriosis 95 dalam perkembangan penyakit ini.3,4 Penelitian i...

0 downloads 28 Views 153KB Size
Majalah Obstetri & Ginekologi, Vol. 22 No. 2 Mei - Agustus 2014 : 94-100

Pengaruh Genistein terhadap Penurunan Kadar Vascular Endothelial Growth Factor-A pada Kultur Sel Endometriosis Jehanara1, Sutrisno2, Santoso S3 1 Program Studi Magister Kebidanan, 2Divisi Fertilitas dan Endokrinologi Reproduksi, Departemen Obstetri dan Ginekologi, 3Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya, Rumah Sakit Umum Dr. Saiful Anwar, Malang ABSTRAK Terapi genistein dikembangkan karena bersifat anti-estrogenik, berfungsi sebagai antioksidan, inhibitor proliferasi, dan anti-kanker. Tujuan penelitian ini adalah menganalisa pengaruh genistein berbagai dosis dan waktu inkubasi terhadap penurunan kadar Vascular Endothelial Growth Factor-A (VEGF-A) pada kultur sel endometriosis. Penelitian ini merupakan studi eksperimental yang dilakukan dilaboratorium Fisiologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang dengan menggunakan kultur sel endometriosis. Sampel berasal dari dinding kista endometriosis dari tindakan laparoskopi. Kultur dibagi 7 kelompok, yaitu kelompok tanpa perlakuan dan 6 kelompok yang masing-masing ditambahkan genistein dosis 5 μm/L, 10 μm/L, 20 μm/L, 30 μm/L, 40 μm/L, dan 50 μm/L. Setelah di inkubasi 6, 24, dan 48 jam, supernatannya dilakukanpemeriksaan kadar VEGF-A dengan teknik ELISA. Data hasil pengamatan dianalisis dengan uji ANOVA, uji Tukey, dan uji korelasi. Perbandingan kadar VEGF-A antara kelompok kontrol tidak berbeda signifikan dengan kelompok genistein 5 µM/L dan 10 µM/L pada jam ke-6, tetapi dalam kelompok dosis yang sama berbeda signifikan pada jam ke-24 dan 48. Rerata kadar VEGF-A terendah terdapat pada kelompok genistein 50 µM/L inkubasi 48 jam (97.44 ± 3.42 pg/ml), tetapi tidak berbeda signifikan dengan 40 µM/L Peningkatan dosis Genistein pada jam ke-6, 24, dan 48 akan menurunkan kadar VEGF-A pada kultur sel endometriosis (p<0,05). Simpulan, genistein berbagai dosis dan waktu inkubasi dapat menurunkan kadar VEGF-A. Semakin tinggi dosis genistein dan semakin lama inkubasi kadar VEGF-A pada kultur sel endometriosis cenderung menurun. (MOG 2014;22:94-100) Kata kunci: Kultur sel endometriosis, genistein, VEGF-A

ABSTRACT Genistein therapy is developed as it is anti-estrogenic, has a function as antioxidant, proliferatory inhibitor, and anti-cancer. The objective of this study was to analyze the effect of various genistein doses and incubation times of the decreased concentration of Vascular Endothelial Growth Factor-A on the endometriosiscell culture. This was an experimental study performed in Physiology Laboratorium,Medical Faculty of Brawijaya University Malang, using endometriosis cell culture. Samples derived from the wall of endometriosis cysttaken by laparascopy. The cultures were divided into 7 group, one group was without treatment and six other were with treatment, each of them added by genistein doses of 5 µm/L, 10 µm/L, 20 µm/L, 30 µm/L, 40µm/L, and 50 µm/L. After incubation period of 6, 24, and 48 hours, the supernatant then analyzed of VEGF-A with ELISA. The datas from observation result was analysed with ANOVA test, Tukey test and correlation test. The Comparison of VEGF-A concentration between the control group and genistein group 5 µm/L, 10 µm/L at the 6th hour were not significantly different but they were significantly different at the 24 and 48 th hour later. Most of the lowest VEGF-A concentration were at the genistein group of 50µm/L, 48 hours of incubation (7.44 ± 3:42 pg /ml)but not differerent significantly with group 40µm/L.The Increasing doses of Genistein on the 6th, 24th, and 48th hour could reduce theVEGF-Aconcentration ofthe endometrioticcell culture (p < 0.05). In conclusion, various Genistein doses and incubation timescould reduce the concentration of VEGF-A. The higher dose of genistein and the longer incubation times tend to decreasedconcentration of VEGF-A. (MOG 2014;22:94-100) Keywords: Endometriosis cell culture, genistein , VEGF- A Correspondence: Jehanara,Program Studi Magister Kebidanan Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang, email : [email protected]

PENDAHULUAN

diterima adalah implantasi endometrium yang keluar secara retrograde selama menstruasi berlangsung. Implan endometriosis membutuhkan pembentukan pembuluh darah baru yang disebut angiogenesis untuk perkembangannya.3 Vascular Endothelial Growth Factor-A (VEGF-A) atau yang biasa disebut VEGF saja adalah faktor angiogenesis yang berpengaruh besar

Endometriosis dikarakterisasi sebagai endometrium yang tumbuh di luar kavum uterus.1 Prevalensi dari endometriosis mencapai 6-10% perempuan usia subur dan 50-60% mengalami masalah nyeri pelvik serta infertilitas.2 Patogenesis endometriosis yang paling luas

94

Jehanara et al. : Pengaruh Genistein terhadap Penurunan Kadar VEGF-A pada Kultur Sel Endometriosis

dalam perkembangan penyakit ini.3,4 Penelitian in vivo dan in vitro menunjukkan peningkatan VEGF-A dalam sel endometrium dan cairan peritoneal pada endometriosis.5 Sel endometriosis secara lokal memproduksi estrogen, memilki peranan penting dalam regulasi ekspresi VEGF-A.3

sterilisasi yaitu Larutan I merupakan larutan transport dengan pencucian yang berisi HBSS (Ham’s Balanced Salt Solution) dan gentamicin 50 μg/ml untuk mencegah kontaminasi. Larutan II merupakan larutan disosiasi yaitu larutan yang digunakan untuk memisahkan sel satu dengan sel yang lain, berisi 0,14% kolagenase IV (500 μg/ml) (Sigma), 0,1% Dnase (2,5 μg/ml) (Sigma) dalam HBSS. Ke III, Medium kultur yang terdiri dari DMEM (Dulbecco Minimum Essensial Medium), FBS (Fetal Bovine Serum) merk Gibco, penicillinstreptomycin (Penstrep) 50-100 μg/ml, L-Giutamine 2 mM (Sigma), Steptomycin 50-100 μg/ml (Sigma).12

Genistein unsur utama isoflavon yang ditemukan pada kedelai dan produknya bekerja sebagai antiangiogenik.6 Untuk menimbulkan respon biologis, genistein memiliki struktur serupa estradiol berikatan dengan reseptor estrogen dan berkompetisi dengan estrogen endogen, sehingga dapat memberikan efek estrogenik maupun anti estrogenik.7 Pada studi invitro, genistein dalam rentang konsentrasi 5 μM/L sampai dengan 50 μM/L dapat menekan pertumbuhan sel tumor pada leukemia, limphoma, kanker prostat, kanker payudara, dan kanker paru.8 Penelitian dengan sistem kultur selendometrium berguna untuk identifikasi faktor hormonal dan imunologi yang terlibat dalam proses angiogenik dan antiangiogeniksebagai terapimasa depan.9 Penelitian ini bertujuan mengetahui pengaruh genistein terhadap penurunan Kadar VEGF-A pada kultur sel endometriosis. Diharapkan Dapat digunakan sebagai dasar untuk terapi endometriosis menggunakan genistein melalui efek penurunan kadar VEGF-A.

Prosedur Kultur Spesimen diproses secara aseptik. Jaringan hasil tindakan laparoskopi diletakkan dalam botol berisi larutan I dan harus diolah dalam satu jam. Jaringan dibersihkan dengan menggunakan PBS dan medium serum free yang diletakan pada cawan petri steril 9 cm untuk membersihkan jaringan dari sisa darah pasca tindakan laparoskopi. Setelah jaringan bersih selanjutnya jaringan dicincang sehingga didapatkan potongan jaringan yang berukuran ± 0,5-2,0 mm3 dengan menggunakan scalpel steril. Potongan jaringan sebesar 0,5-1,0 gram dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi steril berukuran 15 ml, yang berisi 10 ml larutan II (enzim disosiasi).

BAHAN DAN METODE

Disosiasi Spesimen tersebut menjadi suspensi sel dengan cara meletakkan tabung sentrifuse yang telah berisi potongan jaringan pada shaker bath dengan arah gerakan secara vertical, inkubasi pada shaker bath dilakukan selama 3-6 jam, suhu 370C yang bertujuan untuk menyebarkan potongan jaringan ke seluruh bagian tabung sampai terlihat suspensi sel yang telah terdisosiasi.

Penelitian ini dilaksanakan bulan Oktober 2013 di Laboratorium Fisiologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang, secara eksperimental antara kelompok kontrol dan kelompok perlakuan yang diberikan genistein dosis 5 μmol/L, 10 μmol/L, 20 μmol/L, 30 μmol/L, 40 μmol/L, 50 μmol/L. Masingmasing kelompok diinkubasi selama 6 jam, 24 jam dan 48 jam. Penentuan lamanya waktu inkubasi berdasarkan penelitian sebelumnya pada kultur sel kanker ovarium dan prostat dalam menilai efek genistein terhadap kadar VEGF.10,11 Hasil penelitian ditabulasi dan disajikan dalam bentuk tabel dan grafik serta dilakukan analisis secara statistik menggunakan program SPSS for Windows 15 dihitung dengan menggunakan uji ANOVA, uji Tukey, serta uji korelasi dan regresi. Probabilitas dianggap bermakna secara statistik apabila didapatkan nilai p<0,05 dengan selang kepercayaan 95%.

Preparat sel tersebut disentrifugasikan pada 1700 rpm dalam waktu 7 menit, kemudian larutan disosiasi dibuang dan sel diresuspensi (larutkan kembali) dalam 10 ml medium kultur. Dilakukan sentrifuge dan supernatan dibuang, kemudian ditambahkan 10 ml medium kultur komplit. Spesimen diinkubasikan secara vertical dalam tabung kerucut selama 5 menit. Supernatan yang mengandung suspensi sel dan medium kultur dipindahkan ke dalam TC Flask, lalu sel diinkubasi di dalam incubator 95% humidified CO2 5% suhu 370C. Dilakukan pengamatan dan pencucian sel pada hari pertama pasca inkubasi sel. Pengamatan sel dilakukan dengan menggunakan mikroskop inverted untuk melihat apakah sel sudah tumbuh atau belum dan apakah terjadi kontaminasi oleh jamur maupun bakteri. Medium kultur diganti 2 hari sekali hingga sel-sel tumbuh dan confluent di dalam TC Flask. Setelah

Bahan Penelitian Sel endometriosis berasal dari dinding kista coklat dan ditetapkan berdasarkan hasil pemeriksaan patologi anatomi. Jaringan diambil melalui tindakan laparoskopi sebanyak 0,5-1gr. Tiga macam larutan yang disaring dengan menggunakan saringan 0,22 mikron untuk

95

Majalah Obstetri & Ginekologi, Vol. 22 No. 2 Mei - Agustus 2014 : 94-100

HASIL DAN PEMBAHASAN

confluent, dilakukan pemeriksaan flowcytometri pada supernatan sel untuk menilai karakterisasi sel endometriosis melalui ekspresi RE α dan RE β.Sel dipanen dengan larutan 0,05% Tripsin. Medium didalam TC flask dibuang lalu dicuci dengan medium tanpa serum, kemudian ditambahkan 2-3 ml larutan 0,05% Tripsin, diinkubasikan selama 7 menit dalam inkubator 95% CO2 5% suhu 370 C lalu observasi di bawah mikroskop sehingga sel-sel lepas semua dari TC flask. Medium komplit (dengan serum) ditambahkan untuk menginaktivasi kerja tripsin. Suspensi sel dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi, ditambahkan medium hingga volume 10 cc, lalu disentrifugasi selama 7 menit pada 1600 rpm sebanyak 2 kali. Setelah itu supernatan dibuang, ditambahkan medium ke dalam endapan sel hingga volume 12 ml.

Hasil uji penurunan kadar VEGF-A berdasarkan dosis genistein Pada rerata jumlah kadar VEGF-A pada kultur sel endometriosis yang dipapar genistein berbagai dosis didapati adanya penurunan kadar VEGF-A pada kelompok perlakukan dengan berbagai dosis. Hasil uji Anova menunjukkan bahwa ada perbedaan yang bermakna (P=0,000<α) terhadap penurunan rerata kadar VEGF-A antara kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan berbagai dosis. Tampak rerata teringgi pada kelompok kontrol sebesar 195.77 ± 4.94epg/ml lalu berangsur menurun dengan semakin tingginya dosis. Rerata terendah didapatkan pada dosis 50 µM/L sebesar 96.62 ± 4.24apg/ml. Hal ini dapat dilihat pada Tabel 1.

Jumlah sel dihitung dengan kamar hitung. Kemudian sel dimasukkan ke dalam setiap sumur (well) percobaan dengan konsentrasi sel 2,6x104 sel/ml. Hasil resuspensi ini dibagi kedalam 6 buah Tc Plate yang berisi 24 well. Kemudian keenam TC plate tadi diinkubasi lagi sampai didapatkan pertumbuhan yang baik. Setelah sel confluent 70-80% pada Tc Plate ke 1 sampai dengan 6 diberikan perlakuan berupa dosis genistein. Tc Plat 1 pada well 1-5 merupakan kontrol yang tidak diberikan perlakukan apapun, hanya diberikan medium kultur saja, well 6-10 dimasukkan genistein dosis 5 μmol/L, well 11-15 diberikan genistein dosis 10 μmol/L begitu pula selanjutnya pada genistein dosis 20 μmol/L, 30 μmol/L, 40 μmol/L dan 50 μmol/L. TC Plate 1 dan 2 merupakan Tc Plate dengan inkubasi 6 jam, Tc plate 3 dan 4 adalah inkubasi genistein 24 jam, sedangkan Tc Plate 5 dan 6 adalah inkubasi genistein 48 jam. Setelah diinkubasi selama 6 jam, 24, jam, dan 48 jam, supernatan yang ada diambil dan dipindahkan ke dalam tabung/tube ependoff 1,5 ml dan disimpan dalam almari es pada suhu -20oC hingga akan dilakukan pemeriksaan kadar VEGF-A dengan menggunakan pemeriksaan ELISA (Merek Komabiotech no. Katalog K0331132). Hal ini dapat dilihat pada Gambar 1.

Hari ke-1

Hasil uji penurunan kadar VEGF-A berdasarkan waktu inkubasi genistein Hasil uji Anova menunjukkan ada perbedaan bermakna (p=0,000) terhadap penurunan rerata kadar VEGF-A antara kelompok waktu inkubasi. Tampak rerata kadar VEGF-A kelompok waktu inkubasi 6 jam lebih besar dan menurun seiring dengan penambahan waktu inkubasi. Hal ini dapat dilihat pada Tabel 2. Hasil uji penurunan kadar VEGF-A terhadap dosis genistein dan waktu inkubasi 6 jam, 24 jam, dan 48 jam Berdasarkan hasil uji Anova, data kadar VEGF-A kultur sel endometriosis dengan pemaparan genistein berbagai dosis dan waktu inkubasi 6 jam, 24 jam, dan 48 jam, diperoleh ada perbedaan bermakna rerata kadar VEGFA pada ketujuh kelompok sampel pengamatan, hal ini ditunjukkan dengan nilai p-value=0,000<α. Hal ini dapat dilihat pada Tabel 3.

Hari ke -3

Gambar 1. Pertumbuhan kultur sel endometriosis

96

Hari ke-7

Jehanara et al. : Pengaruh Genistein terhadap Penurunan Kadar VEGF-A pada Kultur Sel Endometriosis

Tabel 1. Kadar VEGF-A (pg/ml) pada kultur sel endometriosis berdasarkan dosis genistein Kelompok Dosis

Waktu Inkubasi (Mean ± SD) 24 Jam 48 Jam

6 Jam

p-value

Rerata total

Kontrol 5 µM/L

c

195.97 ± 4.35 189.86 ± 3.67c

d

193.94 ± 6.75 155.39 ± 4.00c

d

197.41 ± 4.11 155.75 ± 5.34c

195.77 ± 4.94 167.00 ± 17.35d

10 µM/L 20 µM/L

193.27 ± 6.07c 140.54 ± 3.87b

137.62 ± 3.49b 136.21 ± 3.64b

135.16 ± 3.33b 136.64 ± 5.81b

155.35 ± 28.32c 137.80 ± 4.59b

30 µM/L 40 µM/L

b

b

b

137.21 ± 4.91 101.15 ± 5.71a

134.53 ± 2.87 98.66 ± 4.11a

137.30 ± 3.80 100.08 ± 4.24a

e

0.000<

b

136.35 ± 3.82 99.96 ± 4.42a

50 µM/L 97.44 ± 3.42a 98.18 ± 2.73a 94.23 ± 5.93a 96.62 ± 4.24a Keterangan: pada rerata ±sd jika memuat huruf yang berbeda berarti ada perbedaan yang bermakna (p value<0.05) dan jika memuat huruf yang sama berarti tidak ada perbedaan yang bermakna (p-value>0.05)

Tabel 2. Kadar VEGF-A (pg/ml) pada kultur sel endometriosis BerdasarkanWaktu Inkubasi Waktu Inkubasi

Dosis Genistein (Mean ± SD) 5 10 20 30 40 50 Rerata P µM/L µM/L µM/L µM/L µM/L µM/L total Value 6 jam 195.97c 189.86c 193.27c 140.54b 137.21b 101.15a 97.44a 150.78b ± 4.35 ± 3.67 ± 6.07 ± 3.87 ± 4.91 ± 5.71 ± 3.42 ±40.53 24 jam 193.94d 155.39c 137.62b 136.21b 134.53b 98.66a 98.18a 136.36a 0.000< ± 6.75 ± 4.00 ± 3.49 ± 3.64 ± 2.87 ± 4.11 ± 2.73 ±31.39 48 jam 197.41d 155.75c 135.16b 136.64b 137.30b 100.08a 94.23a 136.65a ± 4.11 ± 5.34 ± 3.33 ± 5.81 ± 3.80 ± 4.24 ± 5.93 Keterangan: pada rerata ±sd jika memuat huruf yang berbeda berarti ada perbedaan yang bermakna (p-value<0.05) dan jika memuat huruf yang sama berarti tidak ada perbedaan yang bermakna (p-value>0.05) Kontrol

Tabel 3. Kadar VEGF-A (pg/ml) pada kultur sel endometriosis berdasarkan dosis genistein dan waktu Inkubasi 6 Jam Kelompok Perlakuan

Rerata ± SD

24 Jam P Value

Rerata ± SD

48 Jam P Value

Rerata ± SD

Kontrol

195.97 ± 4.35c

193.94 ± 6.75d

197.41 ± 4.11c

5 µM/L

189.87 ± 3.67c

155.40 ± 4.01c

155.75 ± 5.34c

10 µM/L

193.27 ± 6.06c

137.62 ± 3.49b

135.16 ± 3.34b

20 µM/L

140.54 ± 3.86b

30 µM/L

137.21 ± 4.91b

134.53 ± 2.87b

137.30 ± 3.80b

40 µM/L

101.15 ± 5.71a

98.66 ± 4.11a

100.08 ± 4.24a

0.000<

136.21 ± 3.64b

0.000<

136.64 ± 5.82b

P Value

0.000<

50 µM/L 97.44 ± 3.42a 98.18 ± 2.73a 94.23 ± 5.93a Keterangan: pada rerata ±sd jika memuat huruf yang berbeda berarti ada perbedaan yang bermakna (p value<0.05) dan jika memuat huruf yang sama berarti tidak ada perbedaan yang bermakna (pvalue>0.05)

Tren penurunan rata-rata kadar VEGF-A dengan waktu inkubasi 6 jam, 24 jam, dan 48 jam, dimulai dari kelompok kontrol berturut-turut terjadi penurunan ratarata kadar VEGF-A pada kelompok perlakuan

pemberian genistein seiring dengan dosis yang meningkat pada setiap waktu inkubasi (6 jam, 24 jam, dan 48 jam). Ditunjukkan pula rata-rata paling rendah kadar VEGF-A pada kelompok perlakuan genistein 50

97

Majalah Obstetri & Ginekologi, Vol. 22 No. 2 Mei - Agustus 2014 : 94-100

µmol/L waktu inkubasi 48 jam ((94.23 ± 5.93 pg/ml). Hal ini dapat dilihat pada Gambar 2.

0,000. Koefisien determinasi (R-square) sebesar 0,815 menunjukkan bahwa dalam penelitian ini kadar VEGFA waktu inkubasi 24 jam pada kultur jaringan endometriosis dipengaruhi oleh dosis genistein sebesar 81,5%. dan kadar VEGF-A dipengaruhi oleh variabel lain selain dosis genistein yang tidak diteliti dalam penelitian ini sebesar 18,5%.Berdasarkan hasil analisis, pada waktu inkubasi 48 jam didapatkan koefisien regresi sebesar -1,664 dengan signifikansi sebesar 0,000. Koefisien determinasi (R-square) sebesar 0,793 menunjukkan bahwa dalam penelitian ini kadar VEGFA waktu inkubasi 48 jam pada kultur jaringan endometriosis dipengaruhi oleh dosis genistein sebesar 79.3% dan kadar VEGF-A dipengaruhi oleh variabel lain selain dosis genistein yang tidak diteliti dalam penelitian ini sebesar 20.7%. Hal ini dapat dilihat pada Tabel 4.

Hubungan berbagai dosis genistein dengan inkubasi waktu terhadap kadar VEGF-A Berdasarkan hasil analisis regresi pengaruh dosis genistein dan waktu inkubasi terhadap kadar VEGF-A menunjukkan pada waktu inkubasi 6 jam didapatkan koefisien regresi sebesar -2,219 dengan signifikansi sebesar 0,000. Koefisien determinasi (R-square) sebesar 0,929 menunjukkan bahwa dalam penelitian ini kadar VEGF-A waktu inkubasi 6 jam pada kultur jaringan endometriosis dipengaruhi oleh dosis genistein sebesar 92,9% dan kadar VEGF-A dipengaruhi oleh variabel lain selain dosis genistein yang tidak diteliti dalam penelitian ini sebesar 20.7%.Berdasarkan hasil analisis, pada waktu inkubasi 24 jam didapatkan koefisien regresi sebesar -1,609 dengan signifikansi sebesar

Gambar 2. Tren penurunan rata-rata kadar VEGF-A pada waktu inkubasi 6 jam, 24, jam, dan 48 jam

Tabel 4. Uji regresi pengaruh dosis genistein terhadap kadar VEGF-A (pg/ml) Persamaan Regresi

Prosentase pengaruh

P

6 Jam

y = – 2,219 X + 199,904

92,9%

0,000

24 Jam

y = – 1,609 X + 171,991

81,5%

0.000

79,3%

0.000

Waktu Inkubasi

48 Jam y = – 1,665 X+ 173,515 Keterangan: Y= kadar VEGF-A pada kultur sel endometriosis X= dosis genistein

98

Jehanara et al. : Pengaruh Genistein terhadap Penurunan Kadar VEGF-A pada Kultur Sel Endometriosis

Pada penelitian ini didapatkan satu sampel jaringan endometriosis dengan hasil pemeriksaan PA positif endometriosis. Hasil pemeriksaan flowcytometri terdapat 87,16% ekspresi reseptor estrogen, dimana RE β (55,18 %) lebih dominan dibandingkan dengan RE α (30,40 %). Hal ini menunjukkan bahwa tingkat kadar estrogen sel endometriosis ini tinggi. Pada kultur sel stroma dan kelenjar endometrium yang tinggi tingkat estrogennya, genistein bersifat antagonis dan menurunkan efek estrogenik.8,13 Genistein cenderung memiliki afinitas yang tinggi pada RE-β, namun walaupun genistein memiliki afinitas yang hampir sama dengan 17-β estradiol, induksi transformasi struktural dari RE-β tidak cukup untuk memfasilitasi pengikatan co activator dalam proses transkripsi gen.14 Mekanisme ini menghambat estrogen untuk mengaktifkan gen dalam menstimulasi produksi protein spesifik untuk pertumbuhan sel termasuk VEGF-A.

dimulai pada 5 μM/L sampai dengan 50 μM/L menurunkan kadar VEGF dimulai pada waktu inkubasi 6 jam dengan penurunan maksimal pada inkubasi waktu 36 jam dan 72 jam dan penurunan rerata VEGF paling rendah pada konsentrasi 50 μM/L.17 Berdasarkan hasil analisis regresi linier menunjukkan bahwa pada jam ke6, 24, dan 48 terdapat perbedaan yang signifikan (p<0,005) dari dosis genistein terhadap kadar VEGF-A pada kultur sel endometriosis dan dapat dikatakan penurunannya paling rendah pada jam ke-6 (koefisien regresi -2,219 dan r square 92,9% paling besar diantara waktu pengamatan lain). Ini menunjukkan bahwa pengaruh genistein pada kadar VEGF-A tidak hanya tergantung pada reaksi genomik melainkan juga melalui mekanisme non genomik. Mekanisme kerja genistein non genomik membutuhkan waktu kurang dari 20 menit dan mekanisme genomik biasanya membutuhkan waktu yang lebih lama (30 menit sampai beberapa hari) (Dongmin, 2005). Mekanisme melalui jalur non genomik,genistein merupakan inhibitor tirosin kinase yang menghambat fosforilasi tirosin pada p38 MAPK, dan selanjutnya mengarah pada inaktivasi dari jalur MAPK.17,18 Inhibisi jalur MAPK dapat menghambat AP-1 yang dapat memediasi ekspresi gen.18 Aktivasi jalur sinyal P38 MAPK diperlukan untuk memediasi sekresi VEGF pada sel epitel dan stroma endometrium ektopik.19Sehingga penghambatan jalur MAPK melalui inhibisi tirosin kinase oleh genistein dapat menurunkan produksi VEGF-A.

Dosis genistein mempunyai peran penting pada timbulnya respon. Hasil analisis Anova berdasarkan dosis genisteindengan inkubasi waktu 6 jam, 24 jam, dan 48 jam, menunjukkan adanya penurunan kadar VEGF-A yang bermakna dengan penambahan genistein pada kultur sel Endometriosis (p<0,005). Hal ini juga didukung hasil uji regresi yang diperoleh bahwa terdapat pengaruh yang sangat bermakna antara dosis (5 µM/L, 10 µM/L, 20 µM/L, 30 µM/L, 40 µM/L dan 50 µM/L) dan waktu inkubasi (6 jam, 24 jam dan 48 jam) (p<0,000), semakin tinggi dosis genistein dan semakin cepat waktu paparannya maka kadar VEGF-A semakin menurun. Hasil penelitian tersebut mendukung penelitian terdahulu bahwa peningkatan pemberian dosis genistein 5 µM – 160 µM dalam kultur sel kanker ovarium, memiliki potensi semakin menurunnya konsentrasi VEGF.10 Efekantiangiogenik genistein dimediasi oleh penghambatan faktor hypoxia-inducible1 (HIF-1), suatu regulator pentingendotel vaskular faktor pertumbuhan(VEGF) kadar gen, khususnya di bawah kondisi oksigen rendah.15 Studidalam in vitro sel kanker prostat menghasilkan, genistein pada konsentrasi 10 μM sampai dengan 50 μMsignifikan menghambat sekresi VEGF yang dimediasi melalui jalur HIF-1α.16

Mekanisme jalur genomik di mediasi oleh efek genistein yang dapat mengikat dan merangsang sintesa sex hormone binding globulin (SHBG).20 Perubahan dalam konsentrasi SHBG dapat menghasilkan perubahan konsentrasi hormon steroid yang beredar, akibatnya makin banyak estrogen yang terikat dengan globulin dan makin sedikit estrogen yang bebas. Penurunan kadar estrogen ini mengakibatkan penurunan sekresi VEGF-A karena Estrogen Response Elemen(ERE) merupakan salah satu faktor transkripsi dari pembentukan MRNA VEGF.Sifat genistein sebagai anti estrogen bekerja dengan menduduki reseptor sehingga menutup akses ko aktifator dan berinteraksi dengan ko represor setelah komplek estrogen-reseptor mengikat pada ERE, sehingga aktifitas transkripsi gen untuk memproduksi suatu protein pertumbuhan tidak aktif.21 Mekanisme penekanan aktifitas transkripsi ini dapat mengakibatkan penurunan produksi VEGF-A.

Genistein yang merupakan SERM berinteraksi selain pada tingkat paparan juga tergantung pada waktu. Hasil uji tukey tabel 3di atas, genistein dengan dosis 5 µmol/L dan 10 µmol/L dalam inkubasi waktu 6 jam tidak berbeda signifikan dengan kelompok tanpa perlakuan namun inkubasi waktu 24 jam dan 48 jam menunjukkan berbeda secara signifikan. Sehingga, untuk menurunkan kadar VEGF-A dalam kontek kultur sel endometriosis ini pada pemberian genistein dosis 5 µmol/L dan 10 µmol/L membutuhkan waktu inkubasi yang lama.Hasil tersebut berbeda padapenelitian in vitro sel kanker prostrat, genistein dengan peningkatan konsentrasi yang

SIMPULAN Pemberian genistein berbagai dosis dan waktu berpengaruh terhadap penurunan kadar VEGF-A pada

99

Majalah Obstetri & Ginekologi, Vol. 22 No. 2 Mei - Agustus 2014 : 94-100

kultur sel endometriosis dengan efek pencapaian nilai rerata terendahpada genistein dosis 50 μM/L dalam waktu inkubasi 48 jam. Diperlukan penelitian lebih lanjut yang menambahkan zat-zat antiangiogenesis atau kombinasinya dengan hormonal dan melihat pengaruhnya pada kadar VEGF-A kultur sel endometriosis.

11. Yu X, Mi M, Zhu J. Genistein Inhibits the Expression of Vascular Endothelial Growth Factor in MDA-MB-453 Breast Cancer Cells. Chinese journal of lymphology and oncology. 2008;7:1-2. 12. As’adi AS, Hestiantoro A, Arleni. Efek Zat Aromatase Inhibitor dan GnRH Agonis Terhadap Kadar Vascular Endhotelial Growth Factor-A Pada Kultur Sel Endometriosis. Maj Obstet Ginecol Indones. 2008;32(1):11-21. 13. Kayisli UA, Aksu CA, Berkkanoglu M, Arci A. Estrogenicity of isoflavon on human endometrial stromal and glandular cells. The journal of clinical endocrinology and metabolism. 2002;87(12):553944. 14. Morito K., Hirose T, Kinjo J, Hirakawa T, Okawa M, Nohara T, et al. Interaction of Phytoestrogens with Estrogen Receptors α and β. Biol. Pharm. Bull. 2001;24(4):351-6. 15. Buchler P, Reber HA, Buchler MW, Fries H, Lavey RS. Antiangiogc activity of genistein in pankreatic Carcinoma Cells is Mediated by the Inhibition of Hipoxia-Inducible Factor-1 and the DownRegulation of VEGF Gene Expression. Cancer. 2004;100(1):201-10. 16. Guo Y, Wang S, Hoot DR, Clinton SK. Suppression of VEGF-Mediated Autocrine and Paracrine Interactions Between Prostate Cancer Cells and Vascular Endothelial Cells by Soy Isoflavones. Abstracts J Nutr Biochem. 2007;18:408-17. 17. Li Y, Sarkar FH. Down-regulation of invasion and angiogenesis-related genes identified by cDNA microarray analysis of PC3 prostate cancer cells treated with genistein, Cancer Letters. 2002;186(2):157-164. 18. Banerjee S, Li Y, Wang Z, Sarkar FH. MultiTargeted Therapy of Cancer by Genistein. Cancer Lett. 2008;269(2):226-42. 19. Veillat, Ce´ dric C, Christine NM, Yousef AA, Paul HN, Akoum A. Macrophage Migration Inhibitory Factor Elicits an Angiogenic Phenotype in Human Ectopic Endometrial Cells and Triggers the Production of Major Angiogenic Factors via CD44, CD74, and MAPK Signaling Pathways. J Clin Endocrinol Metab. 2007.;95:403-12. 20. Pomfrey VJ, Genistein: A Multimechanistic Anticancer Agent from Soya. www.vivienpomfrey.co. id/Genistein.pdf. Diakses pada 2 Desember 2013. 21. Gruber CJ, Gruber DM, Isabel ML,Wieser F. Anatomy of the Estrogen Response Element. TRENDS in Endocrinology and Metabolism. 2004;15(2).

DAFTAR PUSTAKA 1.

Hsu HL, Khachikyan IK, Stratton P. Invasive and Noninvasive Methods for the Diagnosis of Endometriosis. Clinical Obstetrics and Gynecology. 2010;53(2):413-9. 2. Giudice LC. Endometriosis. Nengl J Med. 2010;362(25):2389-98. 3. Taylor RN, Yu J, Torres PB, Schickedanz AC, Park JK., Mueller MD, Sidell N. Mechanistic and Therapeutic Implications of Angiogenesis in Endometriosis. Reprod Sci. 2009;16(2):140-6. 4. Artini PG, Ruggiero M, Papini F, Simi G, Cela V, Genazzani AR. Endometriosis and angiogenic factors. Endometriosis - basic concepts and current research trends. Prof. Koel Chaudhury edition. 2012. 5. Cosın R, Estelles GJ, Ramon LA, Estelles A. Influence of Peritoneal Fluid on the Expression of Angiogenic and Proteolytic Factors in Cultures of Endometrial Cells From Women With Endometriosis. Human Reproduction. 2010;25(2):398-405. 6. Polkowski K and Mazurek AP. Biological Properties of Genistein. A Review of In Vitro and In Vivo Data. Drug Researdh. 2000;57(2):135-55. 7. Chang EC, Charn TH, Park SH, Helferich WG. Estrogen Receptors α and β as Determinants of Gene Expression: Influence of Ligand, Dose, and Chromatin Binding. Molecular Endocrinology. 2008;22(5):1032-43. 8. Sha GH and Lin SQ. Genistein Inhibits Proliferation of Human Endometrial Endothelial Cell in Vitro. Chin Med sci j. 2008;23(1):49 -53. 9. Laschke MW, Menger M. In Vitro and In Vivo Approaches to Study Angiogenesis in the Pathophysiology and Therapy of Endometriosis. Institute for Clinical and Experimental Surgery. Human Reproduction Update. 2007;13(4):331-42. 10. Haito L, Jiang BH, King SM, Chen YC. Inhibition of Cell Growth and VEGF Expression in Ovarian Cancer Cells by Flavonoids. Nutrition and Cancer. 2008;60(6):800-9.

100